Формалиновый пигмент

[Boroda]

Уважаемые коллеги!

 

Вот посмотрите на нашу беду. Формалиновые пигменты замусоривают срезы.

Мы уже и формалин с буфером пытались применять и отмывать, но толку мало. Селезёнка стандартно с пигментом получается. Не только мешает сомтреть, но и фотографировать.

 

Есть у вас такая проблема? Как с ней бороться?

[dospan]

Уважаемый Борода, увы, это извечная проблема гистологической лаборатории...

Нашел по данной проблеме следующее:

При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок (результат реакции формалина с гемоглобином ткани). Пигмент удаляют, помещая срезы на 15—20 мин в 1—5 % раствор аммиака или 70 % спирт. После промывания водой препарат можно окрашивать. Хорошо удаляется пигмент в растворе 1 % гидроксида калия в

80 % спирте (1:25): после 10-минутной экспозиции препарат промывают в проточной воде в течение 5 мин.

 

Формалин. Основным, широко применяемым фиксатором служит формалин, представляющий собой 40% раствор формальдегида. Формальдегид – это газ, растворимый в воде до концентрации 40% по массе, каким он и поступает в продажу под названием «Формалин». В гистологической практике используют 10% раствор формалина, что соответствует 4% формальдегиду. Из формальдегида готовят нейтральный (забуференный до рН 7,0) 10—12% формалин. Для этого в банку с 40% формалином засыпают карбонат кальция или магния либо смесь этих солей — доломит из расчета 100 г на 1 л формалина. Для получения 10 % нейтрального формалина через 24 ч к 1 части 40% нейтрального формалина добавляют 9 частей водопроводной воды. Продолжительность фиксации 24— 48 ч при 20°С

В водных незабуференных растворах формальдегид со временем превращается в муравьиную ки-слоту, метиловый спирт и ацетон, которые ухудшают качество фиксации, как и выпадение белого осадка параформальдегида.

В результате точную концентрацию формальдегида в растворах формалина установить не представляется возможным. Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70—80° С (в вытяжном шкафу!), и использовать для фиксации. Очищенный коммерческий параформальдегид применяют как составную часть многих фиксаторов для гистохимических и электрон-но-микроскопических исследований.

Фиксатор может показывать себя не с лучшей стороны из-за примесей, в основном метанола(до16%).

 

Для этого существуют методы приготовления фиксатора, свободного от метанола

 

4% ф-д по Гайеру

2 г параформальдегида + 50мл 0,1М фосфатного буфера(рН 7,4-7,6) нагревают до 70с до просветления раствора, помешивают, охлаждают и фильтруют. Его рН 7,3-7,5.

 

40% ф-д по Глауерт

готовят 40% параформальдегид (40г порошка формальдегида + 100 мл дистиллированной воды при нагревании до 65С, перемешивая) + несколько капель 40%гидроксида натрия до просветления раствора.

 

Солевой формол.

Нейтральный 40% формалин 100 мл

Хлорид натрия 8,5 г

Водопроводная вода 900 мл

Продолжительность фиксации 48 ч при 20° С с последующей промывкой в проточной воде в течение 6—12 ч.

 

Универсальным фиксатором, пригодным для гистологических и большинства гистохимических исследований, является нейтральный формалин по Лилли).

 

А. 100 мл 40 % формалина + 900 мл дистиллированной воды.

Б. 4 г дигидроортофосфата натрия моногидрата (однозамещенного фосфата натрия).

В. 6,5 г гидроортофосфата натрия (двузамещенного фосфата натрия).

 

Фиксатор Лилли для кислых гликозаминогликанов

1.Нитрат свинца 8гр

2.40% раствор формальдегида 10мл

3.вода 10мл

4.этанол 80мл

продолжительность фиксации 24 часа при комнатной температуре (при 4С – 2-3дня, 10-14 дней при –25С).

 

Фиксатор Жандра для гликогена

1.Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте 85 частей

2.Раствор формальдегида 40% 10 частей

3.Ледяная уксусная кислота 5 частей

[Andrey]

Есть у вас такая проблема? Как с ней бороться?

У нас нет. Может быть потому, что применяется специальный формалин со специальным буфером к нему.

Поставляется в канистрах: 1 канистра формалина + 1 канистра фосфатного буфера. Считать ничего не надо. Просто содержимое этих канистр выливается в воду и последняя доливается до метки.

Т.е. этот набор просто исключает какое-либо экспериментирование, равно как использование незабуференного формалина.

 

Там где применялся кислый и неизвестно какой формалин такая проблема была. Применение буфера и свежего формалина как правило ее снимало.

 

Мы уже и формалин с буфером пытались применять...

В свете сказанного это смущает. Мож чего не так сделали? Проверьте прописи или возьмите что-то типа описанного выше готового набора.

[Гость TMA_lad]

Уважаемый Boroda,

Еще одной из причин может являться нейтрализация формалина карбонатом кальция.

[Boroda]

Уважаемый коллеги!

Спасибо за помощь! Мы ранее покупали обычный дешёвый формалин канистрами в высоких концентрациях. Потом я решил дорогой покупать. Пришёл представитель с фирмы и принёс две канистры забуференного готового формалина для испытаний. Раза в два дороже получилось, правда растворы готовые, даже разводить водой ничего не надо.

 

Все растворы поменяли, прогнали с десяток случаев, но толку мало. Где крови много, там опять пигмент виден. Послал я эту фирму..., договор ещё не заключили и перешёл опять на дешёвый формалин. Прогнали 10 случаев и дали коллегам посмотреть для сравнения. Разницы вообще никакой не видно. Что забуференный, что обычный формалин дают немного формалиновый пигмент в некоторых органах, например в селезёнке. Теперь прошу лаборантку отмывать пигмент если заметит. Вроде немного стабилизировалось опять всё, но пигмент всё равно периодически вылазит.

 

Зло меня берёт, не могу понять где "собака зарыта".

[vulture]

Вот как бывает. Полез за ссылкой для ответа на вопрос Ледигист, а нашел ответ для ответа в другую тему :wow:/>

 

"... Удаление формалинового пигмента. Кристаллы темно-коричневого формалинового пигмента периодически откладываются после фиксации мягких тканей с кровоизлияниями в кислом растворе формалина - и редко обнаруживаются при использовании нейтрального или забуференного формалина. Они могут быть удалены на этапе окраски путем использования насыщенного раствора пикриновой кислоты в этиловом спирте. Приготовьте насыщенный раствор пикриновой кислоты в 100%-ном этаноле (или промышенном метиловом спирте). Выдерживайте обезжиренные кусочки тканей в течение необходимого периода времени (от 15 минут до полусуток), затем тщательно промойте водопроводной водой..."

 

Цит. по "Neuropathology techniques. T.P. Dawson, J.W. Neal, L. Llewellyn, C. Thomas. Arnold, 2003". p. 118".

[Гость DrPain]

В старину опытные люди в формалин мел порошковый добавляли 100 г на литр(Меркулов) и никаких пигментов :rules:/> ;)/>